Die Struktur der DNA

Die Chargaff'schen Regeln

Ein wirklich großer Fortschritt im Verständnis des Aufbaus der DNA wurde erzielt, als es möglich wurde, die Basenzusammensetzung in der DNA vieler verschiedener Organismen quantitativ zu erfassen. Der mit diesen bahnbrechenden Arbeiten der frühen 50er Jahre verknüpfte Name ist sicherlich Erwin Chargaff. Ohne seine saubere quantitative Analytik der Basenzusammensetzung in sehr vielen verschiedenen DNAs ganz unterschiedlicher organismischer Herkunft wäre die Strukturaufklärung der DNA nicht möglich gewesen.

Der prinzipielle Arbeitsablauf einer Basenanalyse sieht so aus:

  • Zellaufschluß - Reinigung der DNA
  • Totalhydrolyse der DNA in wasserfreier Ameisensäure unter Luftabschluß bei 150°C
  • chromatographische Trennung der Basen (damals auf Papier, später Dünnschicht und HPLC)
  • Elution der Basen
  • photometrische Bestimmung der Basenmengen

Die Auswertung der quantitativen Daten ergab für alle DNAs, unabhängig von ihrer Herkunft die folgenden Gesetzmäßigkeiten:

     [A] = [T]
     [G] = [C]
[Purine] = [Pyrimidine]

Diese strenge Gesetzmäßigkeit darf nicht drüber hinwegtäuschen, daß die Zusammensetzung der DNA bei den verschiedenen Organismen recht verschieden sein kann. Zur Charakterisierung einer DNA ist es üblich, den Gehalt an [G] + [C] Paaren in % anzugeben. Allein bei Bakterien variiert der GC-Gehalt zwischen 25% und 75%. Alle Wirbeltiere - etwa Mensch, Lachs, Frosch, Maus und Huhn- sind beschränkt auf den engen Bereich zwischen 40% und 44%. Die nahe Verwandtschaft aller Vertebraten spiegelt sich shon in einem einfachen Parameter wie dem GC-Gehalt wieder. In der Tat kann man den GC.Gehalt auch in anderen Gruppen von Lebewesen für systematische Zwecke heranziehen. Es kommt nicht vor, daß der GC-Gehalt innerhalb einer Art stark variiert. Wenn doch, dann ist sicherlich bald eine Revision dieser Art fällig. Schon anhand dieser sehr knappen Auswahl von Daten wird Ihnen klar, daß die Bakterien stammesgeschichtlich keine homogene Gruppe bilden. In der Regel ist die Vermutung zulässig, daß Bakterien mit sehr ähnlichem GC-Gehalt miteinander verwandt sind. In der Tabelle läßt sich das am Beispiel von Escherichia coli, Shigella dysenteriae und Salmonella typhimurium verdeutlichen. Diese drei Gattungen, die alle zu den Enterobakterien, also zu den Darm-bewohnenden Mikroorganismen von Säugetieren gehören, sind auch nach allen anderen Kriterien nah miteinander verwandt. Diese Verwandtschaft wird besonders deutlich im Hinblick auf den genetischen Austausch, in dem die drei genannten Gattungen miteinander stehen. Gene können mit Hilfe parasexueller Mechanismen innerhalb dieser Bakteriengruppe zwischen den Arten übertragen werden. Die sogenannte Artgrenze ist eine zweifelhafte, beinahe mehr ideologischen Hypothese. Auch bei den sogenannten höheren Organismen sind Artgrenzen als Barrieren für den genetischen Austausch eher verwischt. Natürlicher horizontaler Gentransfer weit über Artgrenzen hinweg stellt sich bei näherem Hinsehen nicht als Ausnahme sondern eher als Regel dar.

Röntgenstrukturanalyse

Der zweite wichtige Durchbruch in Sachen DNA-Struktur kam aus der Physik, nämlich aus der Röntgenstrukturanalyse. Das Prinzip ist einfach, die zugehörigen Rechnungen nicht:

Kurzwellige Röntgenstrahlen werden fokussiert und auf möglichst regelmäßige Kristalle, in unserem Fall auf saubere, fibrilläre DNA geleitet. Die Wellenlänge der Röntgenstrahlen liegt etwa in der gleichen Größe wie die Durchmesser von Atomen. Damit kommt es dann zu Beugungserscheinungen, ganz analog zu der Situation, die Sie in der Schule am Beispiel der Beugung der Wellen des sichtbaren Lichts am Gitter oder Spalt kennengelernt haben. Das Ergebnis solcher Beugungsphänomene ist eine Ungleichverteilung der Röntgenstrahlintensität jenseits des Kristalls. Diese Intensitätsunterschiede kann man sichtbar machen, indem man einen normalen Röntgenfilm in die Apparatur einbringt, den man dann entwickelt und auswertet. Man kann dann aus den Beugungsmustern mit ein paar Limitationen auf die Anordnung der Atome im bestrahlten Kristall zurückrechenen und erhält somit recht konkrete Vorstellungen über den dreidimensionalen Aufbau der untersuchten Substanz.

Aus der Anordnung und den Abständen der Beugungs- bzw. Interferenzflecken kann man die wichtigsten räumlichen Parameter des DNA-Moleküls ableiten. Man erhält Aufschluß über den Durchmesser des Moleküls und über seine Symmetrie-Eigenschaften. Aus diesen beiden experimentellen Voraussetzungen, der chemischen Basenananalyse, die in die Chargaff'schen Regeln mündete und der Röntgenstrukturanalyse stammt unser Bild von der DNA, das sich als Helix darstellt. Grundlegende räumliche Daten kann man aus der Strukturanalyse ableiten, nicht unbedingt aber die genaue Anordnung der einzelnen Baugruppen zueinander. Die DNA-Röntgendaten gehen experimentell zurück auf Rosalind Franklin, die den Triumph ihrer wirklich genialen Arbeiten nie auskosten durfte, und die auch schon bald nach ihren bahnbrechenden Experimenten noch als junge Frau starb.

Die ersten Röntgendaten wären durchaus auch mit einem Molekül aus drei umeinander gewundenen Strängen kompatibel gewesen. Nach Verfeinerung der Röntgenanalyse bis zu Angstrom-genauen Koordinaten, heute auch anschaulicher bestätigt durch hoch-auflösende elektronenmikroskopische Aufnahmen des DNA-Moleküls, kennen wir heute den Aufbau der DNA sehr genau:

Das Rückgrat der Helix liegt außen und besteht aus zwei alternierend aus Desoxyribose und Phosphorsäure aufgebauten Strängen. Im Innern, über das C1-Atom mit einem Ring-Stickstoff der Basen verknüpft, liegen die Basen. Die Basen sind zwischen den beiden antiparallel verlaufenden Strängen durch schwache, nicht-kovalente Wechselwirkungen, die Wasserstoffbrückenbindungen, miteinander verknüpft.

Modellbau

Die gedankliche Verbindung chemischer und physikalischer Daten zum Doppelhelix-Modell der DNA ist das Verdienst von Francis Crick und James Watson, die für diese Arbeit aus den Jahren 1952/53 dann auch 1962 den Nobelpreis erhielten. Eine ganz wesentliche Rolle bei der Strukturaufklärung spielte der Molekülmodellbau. Anfang der 50er Jahre wußte man bereits, welchen Abstand in den verschiedenen Bindungstypen die Atome voneinander haben. Jeder Strukturvorschlag muß mit diesen Bindunglängen kompatibel sein. Durch einfachen, aber maßstabsgerechten Modellbau kann dann oft eine Vielzahl von Strukturen, die man erdacht hat, gleich wieder ausgeschlossen werden. Eventuell haben Sie solche Molekülmodellbaukästen währen ihrer Chemieausbildung benutzt.

Formen der DNA: Was ist künstlich - was natürlich?

Wenn wir ganz ehrlich sind, müssen wir zugeben, daß für rund 25 Jahre nach der Vorstellung des Watson/Crick'schen Doppelhelix-Modells die Struktur zwar sehr wahrscheinlich, aber letztendlich nicht wirklich stringent bewiesen war. Die endgültigen experimentellen Beweise kamen erst so gegen 1980, zu einem Zeitpunkt also, zu dem ohnehin niemand mehr an der DNA-Struktur zweifelte. Um diese Zeit konnte man kurze DNA-Abschnitte mit definierter Basensequenz, sogenannte Oligonucleotide, synthetisch herstellen. Mit komplementären also exakt basenpaarenden Oligonukleotiden konnte man schöne, ideale Kristalle herstellen, die zu bisher unerreichten Auflösungen in der Röntgenstrukturanalyse führten. Damit gelang der endgültige physikalische Beweis der doppelhelicalen DNA in der postulierten Form wie sie schon lange in den Lehrbüchern stand. Die Auflösung war so groß, daß man sogar Abweichungen von der idealen Doppelhelix zeigen konnte. Abhängig von der Art der Basenpaarung ist das Zucker/Phosphat-Rückgrat ein klein wenig verzerrt, da die Form der möglichen Basenpaare nicht ganz exakt gleich ist.

DNA kann in mehr als einer Konformation kristallisieren. Der Blick auf die Beugungs- bzw. Interferenzflecken der fünf verschiedenen, bekannten Konformationen (A, B, C, D, Z-DNA) lohnt.

In welcher Form die DNA jeweils im Experiment vorliegt, hängt stark von physikalischem Parametern ab, z.B. vom Wassergehalt der Probe. Wichtiger für uns ist die Abhängigkeit der Konformation von der Basenzusammensetzung. Molekülmodelle der fünf verschiedenen Konformationen zeigen die hohe Symmetrie aller möglichen Konformationen, besonders schön beim Blick auf die DNA in Richtung der Längsachse: Die Muster erinnern an dekorative Spitzendeckchen.

B-DNA

B-DNA, ist die Form der DNA, die in unseren Genomen mit großem Abstand die häufigste ist. Diese DNA ist rechts-gewunden. Für eine Windung werden 9.8 Basenpaare gebraucht; das Molekül hat einen Durchmesser von 3,4 A. Besonders in der Aufsicht wird deutlich, daß wir ein hochgradig geordnetes Molekül vor uns haben. Nur aufgrund dieses hohen Ordnungsgrades kann es überhaupt zu den verhältnismäßig einfachen, symmetrischen Röntgenbeugungsmustern kommen.

A-DNA

Im Normalfall liegt DNA in der B-Konformation vor. Bei starkem Wasserenzug geht DNA allerdings in die A-Form über. Es ist nicht klar, ob es in der lebenden Zelle nennenswerte dauerhafte Bereiche der DNA in der A-Form gibt. Als weitgehend sicher gilt aber, daß A- und B-Form dynamisch ineinander überführt werden können. Die A-Form von Nukleinsäuren spielt aber eine Rolle bei Hybridmolekülen von DNA und RNA. Sie wissen, daß die genetische Information für ihre Nutzung in der Zelle in RNA überschrieben wird. Komplementär zu einem der DNA-Stränge wird eine RNA abgelesen, die durchaus zunächst noch über einen gewissen Bereich mit der DNA über normale Watson/Crick-Basenpaarungen verbunden ist. Diese Hybride liegen in etwa in der A-Konformation vor. Auch RNAs, sofern sie doppelsträngig vorliegen (intramolekulare Rückfaltungen oder dsRNA in bestimmten Bakteriophagen) nehmen A-Konformation ein. Die B-Form ist für RNAs auch gar nicht möglich, weil die zusätzliche Hydroxylgruppe an der Ribose im Vergleich zu Desoxyribose die Ausbildung der B-Struktur verhindert.

C-DNA

Eine röntgenographisch andere Form der DNA erhält man, wenn man das Lithium-Salz der DNA bei sehr geringen Wassergehalt herstellt. Es ist aber nicht klar, ob es so etwas auch in vivo, im lebenden Organismus gibt.

D-DNA

Normale, durchschnittliche DNA nimmt keine D-Konformation an. Eine Ausnahme bilden solche Regionen, in denen sich A und T-Paare ganz regelmäßig abwechseln. Eine zweite Ausnahme ist die DNA des Bakteriophagen T2, die immer in der D-Konformation vorliegt. Der Grund dafür liegt in einer chemischen Besonderheit dieser DNA. T2 enthält kein Cytosin sondern ein Derivat davon, das 5-Hydroxymethylcytosin. Zusätzlich ist die Hydroxylgruppe auch noch mit Glucose veräthert.

Die Basenpaarungseigenschaften dieser sonderbaren Base sind die gleichen wie die von Cytosin. Der dreidimensionale Aufbau des DNA-Moleküls sieht aber jetzt etwas anders aus. Das Ergebnis ist DNA in der D-Konformation.

Z-DNA

Alle bisher besprochenen DNA-Konformationen haben dieselbe Drehrichtung: sie sind rechtsläufig. Man kann aber prinzipiell auch sehr schöne Modelle bauen, in denen die DNA das Bild einer linksläufigen Schraube bietet. Lange Zeit gab es intensive Auseinandersetzungen darüber, ob es solche linksläufige DNA tatsächlich gibt. Es gibt sie tatsächlich. Wenn Sie Röntgenstrukturanalysen von Oligonukleotiden machen, die aus einer alternierenden Kette von Purinen und Pyrimidinen bestehen, finden Sie eine eindeutig linksgewundene Struktur, die aber ansonsten ganz normale Watson/Crick'sche Basenpaarungen aufweist (Beispiel: poly(dG-dC)). Das Zucker/Phosphat-Skelett dieser DNA ist etwa zickzackförmig angeordnet; daher der Name Z-DNA. Voraussetzung für die Z-Konformation ist eine hohe Ionenstärke; angegeben werden 0,7M MgCl2 oder 2,5M NaCl. Bei niedrigeren Salzkonzentrationen weisen auch solche DNA-Abschnitte eine relativ normale B-Konformation auf. Zumindest in vitro, unter artifiziellen Bedingungen, gibt es also Z-DNA. Wie sieht es aber in vivo aus? Sicherlich gibt es in keinem Zellkern und in der Nähe keines Genophors so hohe Salzkonzentrationen. Das schließt aber nicht aus, daß auch unter anderen Bedingungen die Z-Konformation ausgebildet und aufrecht erhalten werden könnte. DNA-assoziierte Proteine, aber auch andere Ionen in physiologischen Konzentrationen könnten leicht die Rolle von Stabilisatoren übernehmen. Auch DNA-Modifikationen könnten dabei helfen, B-DNA in Z-DNA zu überführen. In der Tat kann man die hohen Salzkonzentrationen durch kleinere Polykationen wie Spermin oder Spermidin in vernünftigen, also millimolaren Konzentrationen ersetzen wie sie auch in der Zelle vorkommen können. Auch die Methylierung von Cytosin zu 5-Methylcytosin fördert die Ausbildung von Z-DNA. Cytosin-Methylierung ist überhaupt nichts seltenes. In vielen Bakterien sind etwa 1-3% aller Cytosinreste methyliert. In manchen Eukaryonten, besonders in Pflanzen, kann der Methylierungsgrad bei über 25% liegen. Man kann sich diese Funktion des Methylcytosins chemisch leicht plausibel machen: Die Methylgruppe ragt in der B-Konformation in die major groove der DNA und verdrängt dort als hydrophobe Gruppe zu einem gewissen Grad Wassermoleküle. Das Wasser spielt aber eine Rolle bei der Stabilisierung der Doppelhelix; die Methylierung wirkt also etwas destabilisierend. Anders ist dies in der Z-Konformation. Hier liegt dann die Methylgruppe ganz zwanglos an einer Stelle, an der die Abwesenheit von Wasser die Helix besser stabilisiert. Besonders bei hohem Methylierungsgrad bietet also die Z-Konformation durchaus thermodynamische Vorteile. Auf der Molekülbau-Seite stellt sich der Übergang von der B- in die Z-Konformation nicht halb so dramatisch dar wie es den Anschein hat. Man kann beide Typen ineinander überführen, ohne daß die Stränge getrennt also Wasserstoffbrücken dauerhaft gelöst werden müssen. Die B nach Z-Transition könnte zwanglos über die DNA-Helix laufen. Thermodynamisch ist der Übergang auch nicht sonderlich dramatisch. Abgesehen von der Aktivierungsenergie in Höhe von 21 kcal/Mol wird kaum weitere Energiezufuhr gebraucht, zumal der Prozeß kooperativ verläuft. Kooperativ heißt: sobald sich eine Z-DNA-Keimzelle gebildet hat, werden Konformationsänderungen in der Nachbarschaft induziert.

Wie sucht man nach Z-DNA in vivo? Man kann in Kaninchen Antikörper gegen synthetisch hergestellte Z-DNA herstellen (gegen chemisch modifiziertes und somit stabilisiertes poly(dG-dC). Mit diesen Antikörpern kann man dann in mikroskopischen Dünnschnitten von fixierten Zellkernen auf die Suche nach natürlich vorkommender Z-DNA gehen (Fluoreszenz-Markierung). Mit dieser Technik kann man in den polytänen Riesenchromosomen aus Speicheldrüsen von Drosphila melanogaster tatsächlich Z-DNA nachweisen. Es gibt also Z-DNA. Hat sie aber auch eine biologische Funktion? Diese Frage läßt sich noch nicht abschließend beantworten. Vieles ist gemessen und diskutiert worden. Abschließende Klarheit herrscht noch nicht. Auf alle Fälle gibt es aber in allen in dieser Hinsicht studierten Organismen zwischen Bakterien, Drosophila und Weizen Proteine, die spezifisch an Z-DNA binden.

Gebogene DNA

Die DNA ist in wässriger Lösung eine recht plastische Struktur, so daß das Molekül gebogen, verdreht und auch gestreckt werden kann. Die Bindungswinkel des Zucker/Phosphat-Skeletts sind nicht ganz so starr wie es den Anschein hat. Kleine Abweichungen sind möglich, so daß die erwähnten Abweichungen von der idealen Doppelhelix problemlos möglich sind. Darüber hinaus gibt es aber auch gelegentlich richtige Knicks in der DNA, die weit über die normale Plastizität hinausgehen. Diese 'Kinks' treten spezifisch an bestimmten, definierten DNA-Sequenzen auf. Eine solche Sequenz ist CAAAAAT, besonders dann, wenn sie mehrfach, am besten immer wieder im Abstand von 10 Nukleotiden auftritt (das ist eine Umdrehung der DNA-Schraube). Gebogene DNA kann aber auch durch die Einwirkung DNA-bindender Proteine erreicht werden. Sie können davon ausgehen, daß Stellen, die als Folge ihrer besonderen Nukleotidsequenz 'Kinks' haben, etwas besonderes darstellen, sozusagen Markierungen oder Wegweiser auf der DNA, die von Proteinen erkannt werden können.

 

© by Johannes Wöstemeyer
Last modified: 10. April 2007 Sun May 8 16:53:50 2005
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